ИСТОРИЯ МЕДИЦИНЫ

Ученые создали биологическую модель легких для изучения коронавирусной инфекции

Ученые вырастили модельные альвеолы из стволовых клеток легких человека. Они подходят для изучения коронавирусной инфекции: авторы исследовали эндогенный иммунный ответ на ранних стадиях заболевания и показали, что для инфицирования клетки может быть достаточно всего одной вирусной частицы. Статья принята к публикации в Cell Stem Cell.

SARS-CoV-2 — вирус, ответственный за пандемию, от которой на сегодняшний день во всем мире умерло уже больше миллиона человек (включая более двадцати пяти тысяч в России). Изучение течения заболевания COVID-19 на клеточном уровне крайне важно для понимания механизмов инфекции, поиска и модификации терапевтических подходов.

Наиболее остро инфекция протекает в легких, где коронавирус заражает альвеолярные клетки второго типа. Эти клетки плохо поддаются культивации в лаборатории, и поэтому существующие модели заболевания, за исключением одной, были созданы на основе иных клеток человека и животных.

Единственная описанная модель, в которой используются альвеолярные клетки второго типа, тоже имеет значительные ограничения. Из-за того, что для ее создания использовали плюрипотентные стволовые клетки (а не донорские клетки легких), на ней невозможно изучать влияние индивидуальных факторов, таких как возраст или состояние здоровья пациента.

Группе ученых из тринадцати институтов Южной Кореи и Великобритании удалось создать трехмерную долгоживущую клеточную культуру человеческих альвеолярных клеток второго типа и изучить ее реакцию на заражение коронавирусом. Основной вклад в работу внесли Джеонгхван Юк (Jeonghwan Youk) , Тэву Ким (Taewoo Kim), Келли Эванс (Kelly V. Evans), Йонг-и Джеонг (Young-Il Jeong) и Йонгсук Хур (Yongsuk Hur).

Культуру вырастили из клеток живого донора, которые были помещены в матригель (matrigel) — желатинообразную среду, похожую на внеклеточное окружение клеток в организме (матрикс). В матригель были также добавлены факторы роста, участвующие в развитии легких. 

В этих условиях альвеолярные клетки образовали различные трехмерные структуры, в том числе похожие на альвеолы цисты, в которых были обнаружены сурфактанты — вещества, препятствующие слипанию альвеол в настоящих легких. Авторы сообщают, что культура остается стабильной даже по истечении шести месяцев, что позволяет использовать ее в долговременных исследованиях.

Типы колоний альвеолярных клеток, сформировавшиеся в матригеле. Слева — окрашивание гематоксилином и эозином, справа — иммуннофлюоресцентное.

Youk, J. et. al. / Cell Stem Cell, 2020

Для изучения механизма развития коронавирусной инфекции, выращенные в культуре клетки исследователи заразили вирусом, выделенным у пациента из Южной Кореи. Для контроля использовались бронхиальные клетки человека, а также клетки линии Vero, полученные от африканских зеленых макак.

Перед заражением исследователи деполимеризовали матригель и разрушили трехмерные структуры, сформированные клетками, чтобы дать вирусу доступ к их апикальной поверхности. Результаты анализировали на первый, второй и третий дни после заражения. Уже через один день в псевдоальвеолах наблюдался значительный титр вируса, что говорит об экспоненциальной репликации даже в первые сутки.

В самих клетках наблюдались агрегаты вирусных частиц и компонентов. Также были обнаружены массивные вакуоли, схожие с возникающими в эпителиальных клетках, инфицированных вирусом Зика.

Группа альвеолярных клеток через два дня после заражения. Красными звездочками показано пространство псевдоальвеолов. Белые стрелочки указывают на агрегаты вирусных частиц, белый пунктир — мембраны клеток. Vc — патологические вакуоли, Nu— ядра.

Youk, J. et. al. / Cell Stem Cell, 2020

При анализе транскриптома (совокупности рнк, позволяющей судить об уровне экспрессии генов), ученые обратили внимание на значительное усиление транскрипции генов, связанных с иммунитетом. Это были гены интерферонов, а также гены, экспрессию которых интерферон стимулирует. Эти гены участвую в противовирусном ответе: они препятствуют входу и выходу вирусов из клеток, подавляют их репликацию и образование белков.

Авторы обращают внимание на то, что источником иммунного ответа здесь были сами альвеолярные клетки — ведь иммунные клетки в модели отсутствовали. По их мнению, это сближает модельную инфекцию с самой ранней стадией болезни человека: до развития инфекции иммунных клеток в легких практически нет. 

В рамках исследования ученые также постарались выяснить, какое количество вирусных частиц, как правило, заражает клетку. Ученые пишут, что существует два возможных сценария: в первом одну клетку заражает одна вирусная частица, во втором заражение происходит несколькими частицами сразу.

Для идентификации типа вируса, заразившего индивидуальную клетку, использовали «молчащую» (то есть не влияющую на виральность возбудителя) мутацию, содержащуюся у небольшой части (около четырех процентов) вирусов, использованных в эксперименте. После заражения количество клеток, содержаших только мутантную РНК (а значит зараженных только мутантным вирусом), оказалось в два раза больше, чем количество тех, в которых обнаружили РНК как дикого, так и мутантного типа (n=8 против 4).

Статистический анализ также показал, что вероятность заражения клетки индивидуальной вирусной частицей более чем в два раза выше. По мнению авторов, это может говорить о возможности вирусной интерференции при развитии легочной коронавирусной инфекции.

Исследователи полагают, что созданная модель будет крайне полезна для понимания механизмов развития заболевания. Для ее усовершенствования они предлагают внести в культуру иммунные клетки, а также создать вариации модели с использованием клеток легких, взятых у пожилых и скончавшихся от этой болезни пациентов.

По мнению авторов, перспективным будет совмещение описанного в статье подхода с другими техниками, такими как совместная культивация с иммунными клетками и проверкой антивирусных препаратов in vitro.

Ну и вне всякой связи с коронавирусной инфекцией, модель может быть использована для изучения биологии альвеолярных клеток второго типа и болезней легких, затрагивающих альвеолы.

По материалам сайта N+1